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22113 miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by tailing A)
产品概述
产品描述
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by tailing A)是miRNA cDNA第一链合成的专用试剂盒(加尾法)。只需一步操作，即可完成加尾反应和逆转录反应。适用于miRNA或总RNA模板，在Poly A Polymerase (PAP)的作用下，在模板3'-末端加Poly (A)，随后进行加尾法逆转录反应。
本试剂盒中包含专为miRNA加尾法逆转录定向改造的ToLoScript III RTase和PAP，配以优化的缓冲体系，在具有高灵敏度的同时，最大限度降低pre-miRNA的逆转录，保证后续结果的稳定性和可重复性。此外，本试剂盒中已提供了后续cDNA定量需要的qPCR反向引物，方便后续的实验流程。推荐使用ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal，#22204）进行cDNA产物后续定量。
产品优势
✽ 便捷的实验操作：只需一步操作，即可完成加尾反应和逆转录反应。
✽ 优异的逆转录性能：含有专为miRNA加尾法逆转录定向改造的ToLoScript III RTase和PAP，配以优化的缓冲体系。
✽ 较高的逆转录特异性：专用的酶与最适的缓冲体系结合，从而能够最大限度降低pre-miRNA的逆转录，保证后续结果的特异性和可重复性。
✽ 适用范围较广：不仅适用于miRNA而且也适用于总RNA模板。
实验案例
1.以293T miRNA为模板(30ng/μl)，使用ToloBio#22113以及其他品牌相关产品，按照各自说明书推荐程序进行逆转录反应，将得到的cDNA分别在六种引物体系（H10/11/15/16/17/19）中进行qPCR定量分析。结果显示，ToloBio #22113在不同引物体系中，逆转录效率优于同类产品。
2.以293T miRNA浓度梯度稀释为模板，使用ToloBio#22113以及其他品牌相关产品，按照各自说明书推荐程序进行逆转录反应，对逆转录反应得到的cDNA进行qPCR定量分析，可以看到，使用Tolobio #22113逆转录miRNA后qPCR检测得到的溶解曲线单峰且峰形优异，特异性更高，且定量效果较好.
实验流程
1.在RNase-free离心管中配制如下反应体系
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组分 |
体积 |
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2×miR RT Buffer (tailing) |
5 μL |
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ToloScript III miR Enzyme Mix (tailing) |
1 μL |
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Total RNA/miRNA |
x μL |
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RNase-free ddH2O |
Up to 10 μL |
用移液器吹打混匀后短暂离心。
2.按下列反应程序进行逆转录反应
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温度 |
时间 |
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37℃ |
60min |
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85℃ |
5min |
逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。为避免逆转录体系对qPCR反应的抑制，可将产物稀释10~1000倍后使用。若短期内不进行下游实验，可-20℃保存。若需长期保存，建议分装后保存于-80℃，避免反复冻融。
产品组成
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组分 |
22113 (50 rxn) |
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● 2 × miR RT Buffer (tailing) a |
250 μL |
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● ToloScript III miR Enzyme Mix (tailing) b |
50 μL |
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○ RNase-free ddH2O |
1 mL |
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● Universal Reverse Primer for qPCR (10 μM) c |
250 μL |
a.包含dNTP、加尾法逆转录引物；
b.包含ToLoScript III RTase、RNase inhibitor；
c.qPCR通用反向引物 (用于后续cDNA定量分析)
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1: #22113这款试剂盒是否含有RNA酶抑制剂？
A1: 是。
Q2: 后续搭配的定量试剂是什么？
A2: #22204是目前测试中表现最好的定量试剂。
Q3: 投入total RNA，所有的RNA都会被加尾吗？
A3: 是的，均会进行无差别加尾。
Q4: #22113这款试剂盒是否既可逆转miRNA，又可以进行常规逆转录？
A4: 该试剂盒是专门针对miRNA逆转录开发的试剂盒，不建议进行常规逆转录（逆转引物有差别，且该逆转录酶是经过定向改造，对较长的RNA逆转效率低）。
参考文献
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