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22106 ToloScript RT EasyMix for qPCR (with 2-Step gDNA Erase-Out)
产品概述
产品描述
该试剂盒中5 × ToloScript RT EasyMix含有新一代逆转录酶ToloScript Reverse Transcriptase (RTase) 和针对逆转录反应优化的最适缓冲液，大大提高了cDNA的合成效率，适用于两步法qRT-PCR检测。试剂盒中4 × gDNA Erase-Out Mix可彻底去除total RNA中残留的gDNA，保证后续定量结果的可靠性，同时也简化qPCR引物设计过程，无需跨内含子设计引物。5 × ToloScript RT EasyMix含有逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板RNA和水即可迅速进行反应，同时含有终止4 × gDNA Erase-Out Mix反应的抑制剂，保证了cDNA的完整性。逆转录产物适用于染料法与探针法qPCR，可进行基因表达的高效分析。
产品优势
✽ 简便快捷的操作：体系中包含逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板RNA，20 min内即可完成逆转录反应，本制品中含有去基因组成分，反转录时可同步去除基因组DNA污染。
✽ 卓越的逆转录效率：含有新一代ToloScript Reverse Trscriptase，具有优越的持续合成能力
✽ 强大的兼容体系：逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR
实验案例
分别使用ToloBio #22106与竞品Supplier A、Supplier B，对293T的RNA进行浓度梯度稀释，用双链DNA染料SYBR实时监测qRCR扩增，比较在相同引物和模板条件下的扩增情况，包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示，ToloBio #22106与竞品相比在不同浓度模板条件下扩增性能稳定、优异。
实验流程
1.gDNA去除
1.1 gDNA去除反应体系
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组分 |
体积 |
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4 × gDNA Erase-Out Mix |
4 μL |
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Template RNA |
x μL (1 pg ~1 μg) |
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RNase-free ddH2O |
Up to 16 μL |
1.2反应程序
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温度 |
时间 |
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42℃ |
2 min |
2. 逆转录反应
2.1逆转录反应体系
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组分 |
体积 |
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第1步的反应液 |
16 μL |
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5 × ToloScript RT EasyMix |
4 μL |
2.2反应程序
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温度 |
时间 |
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37℃ |
15 min |
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85℃ |
5 sec |
• 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，建议先将逆转录体系25℃反应5 min，再将反应温度提高至55℃，有助于提高产量。
• No RT Control指不加逆转录酶的阴性对照体系，取16 μL第1步的反应液加入4 μL 5 × No RT Control Mix作为阴性对照，可用于检验RNA模板中是否有gDNA残留。
产品组分
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组分 |
22106 (100 rxns) |
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● 4 × gDNA Erase-Out Mix |
400 μL |
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● 5 × ToloScript RT EasyMix a |
400 μL |
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● 5 × No RT Control Mix b |
40 μL |
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○ RNase-free ddH2O |
2 × 1 mL |
a. 组分中已包含Buffer、dNTP、ToloScript RTase、RNase Inhibitor、Random primers/Oligo (dT) 20VN primer mix。
b. 除不含RTase和RNase Inhibitor外，其余成分与5 × ToloScript RT EasyMix相同，用于配制No RT对照反应
保存条件
-20℃保存，≤ 0℃运输；
常见问题解答
Q1：如何评判RNA质量
A1：RNA质量从两个方面进行检测：
1.1 RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带（柱式RNA提取kit只有两条带，Trizol有三条带），分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍（理论上是2.7倍，但大多数样品提取的RNA几乎2倍也达不到。若条带清晰且比值大于1，则RNA完整性可以满足绝大部分实验需求。）；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取；若10 kb附近有条带说明有gDNA污染。
1.2 RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值判断：
OD260/280=1.8-2.2，表示纯度较高；
OD260/280 < 1.8，表示存在蛋白污染；
OD260/280 > 2.2，表示可能存在RNA降解。
注：建议使用1%的琼脂糖凝胶，210V电泳10-12 min；加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃，2 min，使RNA变性后再进行电泳，这样跑出来的RNA条带更好看，也更能反应RNA的完整性；
Q2：如何选择逆转录的引物
A2：逆转录三种引物：
2.1 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
2.2 Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
2.3 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。若进行One step RT-qPCR反应时，反转录引物只能使用特异性引物。
引物选择依据：cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端的扩增偏好性。
Q3：对于逆转录加样的操作注意事项
A3：
3.1 4 × gDNA Erase-Out Mix、5 × ToloScript RT EasyMix 及5 × No RT Control Mix含有高浓度的甘油，在使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。
3.2 20 µL逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低，最多加入5 µg total RNA，否则加入RNA量过高，可能会超出后续定量PCR的线性范围。
Q4：可以通过检测逆转录产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A4：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量；cDNA同样不可以纯化，因为逆转得到的cDNA长短不一，纯化会损失短的cDNA。
Q5：cDNA模板需要稀释吗？应该稀释多少倍进行定量？
A5：没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。
注：当使用cDNA原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR反应体系的1/10，因为cDNA中包含很多抑制qPCR的组分，cDNA体积大时风险很高。
Q6：逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗？
A6：可以，和普通的RNA逆转录类似。不过lncRNA比较长，建议在去除基因组步骤前先进行65℃ 5min预变性，打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的lncRNA都包含polyA 尾，所以如果使用逆转录试剂盒，可以同时添加随机引物与Oligo dT两种引物，或者只添加随机引物一种引物，但不能只添加Oligo dT一种引物。
cirRNA为环状闭合结构，没有poly A尾，逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大，比较长的话建议跟lncRNA一样先预变性，正常的话就按照正常程序就行了。
关于引物的选择，总的来讲：
mRNA可以选用随机引物+Oligo dT；随机引物；Oligo dT；GSP（基因特异性引物）；
cirRNA可以选用随机引物；GSP（基因特异性引物）；
lncRNA可以选用随机引物+Oligo dT；随机引物；GSP（基因特异性引物）；lncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。
参考文献
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