产品中心
21807 Tolo MegaPfu DNA Polymerase
产品概述
产品描述
Tolo MegaPfu DNA Polymerase 具有 5'→3'方向的 DNA 聚合酶活性和 3'→5'的 DNA 外切酶活性，能纠正 DNA 扩增过程中产生的碱基错配，是一款高保真 PCR 快速反应酶。Tolo MegaPfu DNA Polymerase 中添加特异性促进因子使其在长片段扩增特异性方面得到了大幅度的提升。使用本品扩增得到的 PCR 产物为平末端，若做 TA 克隆需加 A 处理后再与 T 载体连接。本产品扩增产物可适用于 2 × Ezmax® Universal CloneMix (ToloBio #24305)。
产品组分
|
组分 |
21807-01（100 U） |
21807-02（500 U） |
21807-03（1,000 U） |
|
● Tolo MegaPfu DNA Polymerase |
100 μL | 5 × 21807-01 | 10 × 21807-01 |
|
● 2 × MegaPfu Buffer |
2 × 1.25 mL | ||
|
● dNTP Mix（10 mM each） |
100 μL | ||
|
○ 6 × DNA Loading Buffer |
1 mL |
保存条件
-20℃储存，≤ 0℃运输。
适用范围
本产品适用于以基因组 DNA、cDNA、质粒以及粗品为模板的 PCR 反应。
单位定义
用活化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板/引物，74℃ 30min 内，摄入 10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为 1 个活性单位（U）。
实验流程
1.反应体系
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完后请及时放回-20℃保存。
|
组分 |
体积 |
|
2 × MegaPfu Buffer |
25 μL |
|
Tolo MegaPfu DNA Polymerase |
1 μL |
|
dNTP Mix（10 mM each） |
1 μL |
|
Primer l （10 μM） |
2 μL |
|
Primer 2 (10 μM) |
2 μL |
|
Template DNA a |
x μL |
|
ddH2O |
Up to 50 μL |
a.针对不同来源或类型的模板，所需的反应浓度不同，下表为 50 µl 反应体系推荐的模板使用量：
|
模板种类 |
模板起始量 |
|
动植物基因组 DNA |
0.1-1 µg |
|
大肠杆菌基因组 DNA |
10-100 ng |
|
cDNA |
1-5 μL (不超过 PCR 反应总体积的 1/10) |
|
质粒 DNA |
0.1-10 ng |
|
λDNA |
0.5-10 ng |
2.反应程序
|
Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
Stage 1 |
预变性 | 95℃ | 2 min | 1 cycle |
|
Stage 2 |
循环反应 | 95℃ | 15 sec | 30-35 cycles |
| 56℃ | 15 sec | |||
| 72℃ | 1 ~ 30 sec/kb | |||
|
Stage 3 |
彻底延伸 | 72℃ | 5 min | 1 cycle |
◆ 退火温度需根据引物和模板实际的 GC 含量来作调整；如果需要，可以设置温度梯度摸索引物与模板结合的最适温度。
◆ 当扩增产物长度在 1.5 kb 以下时，支持 1 sec 超快 PCR 延伸；当扩增产物长度在 7 kb 以下时，支持 15 sec 快速 PCR 延伸；当无产物或产物量较少时，可适当增加延伸时间至 30 sec/kb ~1 min/kb。
◆ 如有需要，可适当提高 Tolo MegaPfu DNA Polymerase 的使用量，但 50 μL 体系内酶量建议不超过 1.5 μL。
引物设计
1. 引物长度约 15-30 个碱基，引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C。
2. 引物的 GC 含量控制在 40%~60%之间，Tm 值调整至 55~65℃为佳，若模板本身 GC 含量过高或过低，30%~80%也可。
3. 上下游引物 GC 含量不宜相差过大，Tm 值相差不超过 1℃为佳，引物与模板非配对序列，不应参与引物 Tm 值计算。
4. 引物中四种碱基（A、G、C、T）随机分布，可降低引物与模板相似性，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶。
5. 引物自身及引物之间不应存在连续的互补序列（5 个碱基），引物 3'端避免出现发夹结构。
6. 引物设计好后，可对其进行 blast 检测确定是否有非特异性扩增，NCBI 或 SnapGene 等可实现该功能。
7. 各种模板的引物设计难度不一，对于模板本身比较困难的（如 GC 含量或 AT 含量过高），引物设计应退而求其次，尽量满足以上条件即可。
常见问题解答
Q1: 无产物或产量少？
A1：a) 引物：优化引物设计。
b) 退火温度：设置退火温度梯度，找到合适的退火温度。
c) 引物浓度：适当提高引物浓度。
d) 延伸时间：适当增加延伸时间至 30 sec/kb ~1 min/kb。
e) 循环数：增加循环数至 36 ~ 40 个循环。
f) 模板纯度：使用高纯度模板。
g) 模板使用量：使用量参照反应体系推荐量调整并适当增加或减少。
Q2: 有杂带或弥散条带？
Q2：a) 引物：优化引物设计。
b) 退火温度：尝试提高退火温度并设置退火温度梯度。
c) 引物浓度：适当降低引物浓度。
d) 循环数：减少循环数至 25 ~ 30 个循环。
e) 反应程序：使用两步法或 Touch down PCR 程序。
f) 模板纯度：使用高纯度模板。
g) 模板使用量：使用量参照反应体系推荐量调整并适当减少。
参考文献
COA查询
