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22208 2 × Q5 SYBR qPCR Master Mix (Universal)

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22208 2 × Q5 SYBR qPCR Master Mix (Universal)

  • 规 格:
    • 5×1 mL

货 号:

22208


价 格:

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¥ 1280


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产品概述

产品描述

本产品是适用于 SYBR Green I嵌合荧光法qPCR 反应的专用预混液。其核心组分为一种经过基因工程改造升级的抗体法修饰热启动 DNA 聚合酶,具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点,配以针对qPCR优化的最适反应缓冲液,非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR 反应。本产品是一种含有 SYBR Green I染料的2×预混液,操作简便,且可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,具有靶基因定量准确、重复性好、可信度高等诸多优势。本产品中含有特的 ROX Passive Reference Dye,适用于所有型号的qPCR仪器,无需在不同的机型上调整ROX 的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

 

产品组分

组分

22208-01(500 rxns) 

○  2 × Q5 SYBR qPCR Master Mix (Universal)

5 × 1 mL

组分中已包含 dNTP、Mg2+、Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、ROX Passive Reference Dye等。

 

 

保存条件

-20℃避光保存,≤ 0℃避光运输;

 

 

实验流程

1.在qPCR管中配制如下反应体系

组分

体积 

2 x Q5 SYBR qPCR Master Mix (Universal)

10 μL

Primer F (10 μM)

0.4 μL

Primer R (10 μM)

0.4 μL

Template DNA/cDNA

x μL

ddH2O

Up to 20 μL

反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整:

 · —般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时,可以在终浓度范围0.1-1.0 μM内调整引物浓度。

 ·  qPCR灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后加入反应体系中,这样可以有效提高实验的准确度。 

 ·  如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

 

2.按下列反应程序进行qPCR反应

Stage

程序 

温度 

时间 

循环 

Stage 1

预变性 95℃ 30 sec a 1 cycle

Stage 2

循环反应 95℃ 3-10 sec b 40 cycles
60℃ 10-30 sec c

Stage 3

熔解曲线 仪器默认程序 -

a. 该预变性条件适合绝大多数扩增反应,如模板结构复杂,可将预变性时间延长至3 min,以提高预变性效果。

b. 标准程序选择10 sec;快速程序最短可选3 sec。

c. 标准程序选择30 sec;快速程序:对于200 bp以内的扩增子,延伸时间最短可设为10 sec;超过200 bp的扩增子,推荐设为30 sec。快速程序适用于绝大多数基因,但扩增具有复杂二级结构的基因推荐使用标准程序。

 

常见问题解答

Q1: 扩增曲线形状异常

A1:
1.1扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
1.2扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点(Ct值减4),重新分析数据。
1.3个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心,进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

 

Q2: 反应结束无扩增曲线出现

A2:
2.1 反应循环数不够:一般设置循环数为40, 但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
2.2确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2.3确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。
2.4模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
2.5模板降解:重新制备模板,重复实验。

 

Q3:  Ct值出现太晚

A3:
3.1 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。
3.2 板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
3.3 模板降解:重新制备模板,重复实验。
3.4 PCR产物太长:推荐PCR产物长度为80-150 bp。
3.5 体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

 

Q4:   阴性对照出现明显扩增

A4:
4.1 反应体系污染:更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配置,减少气溶胶污染。
4.2 引物二聚体的出现:配合熔解曲线进行分析。

 

Q5: 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

A5:
5.1 加样误差:提高模板稀释倍数,提高加样体积。
5.2 标准品降解:重新制备标准品,重复实验。
5.3 模板浓度太高:提高模板稀释倍数。

 

Q6: 熔解曲线出现多峰

A6:
6.1 引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。
6.2 引物浓度太高:适当降低引物浓度。
6.3 cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。

 

Q7: 实验重复性差

A7:
7.1 加样体积不准:使用性能较好移液器或将模板多倍稀释后再提高加入反应体系的模板体积。
7.2 定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
7.3 模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

 

产品说明书

#22208 2 x Q5 SYBR qPCR Master Mix (Universal) Manual

pdf

1018.9KB

参考文献

COA查询

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