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24308 2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix

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24308 2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix

  • 规 格:
    • 50 rxns

货 号:

24308


价 格:

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¥ 1080


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产品概述

产品描述

2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix 是基于同源重组原理开发的一步法单片段/多片段通用型无缝克隆试剂盒,Ezmax® 系列重组克隆试剂盒属于非连接酶依赖型体系,载体自连背景极低。高度优化的 2 ×Ezmax® Plus Universal CloneMix 预混了增强型重组酶和重组反应所需缓冲液,可显著提高克隆的重组效率及对杂质的耐受程度,因此制备的高纯度线性化载体和插入片段可不纯化直接用于重组克隆,大大简化了实验操作。

本试剂盒可以一次将 1~5 个顺序拼接的插入片段定向重组至任何载体的任何位点,不受酶切位点限制(特殊情况,如有毒基因的克隆或插入外源片段后导致质粒本身不稳定等除外)。只需在载体末端与插入片段末端以及相邻插入片段末端之间设计 15~25 bp 能够相互同源重组的完全一致的序列,50℃反应 10 min,这些插入片段和线性化载体就可以在重组酶的作用下完成重组,重组产物不依赖连接酶直接转化至感受态细胞,所获得的阳性克隆率在 95%以上。

 

 

产品组分

组分

24308-02(50 rxns)

2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix

500 μL 

Control ( Linearized plasmid + Insert fragment, Ampra

40 μL

a.阳性对照 Control 中包含了 4.6 kb 的线性化载体和 1 kb 的插入片段,Amp 抗性。使用时直接取 10 μL Control 加入 10 μL 2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix ,即组成 20 μL 重组反应体系。

 

 

保存条件

-20℃储存,≤ 0℃运输;

 

 

产品特点

· 可在 10 min 内完成重组;

· 不受酶切位点限制;

· 不引入额外酶切位点序列。

 

 

适用范围

适用于 1~5 个片段的快速无缝克隆、多点突变和高通量克隆等实验。

 

 

原理示意图

 

 

实验流程

详情见说明书。

 

 

注意事项

1. 部分限制性内切酶产生相似的粘性末端,其线性化的载体直接转化大肠杆菌可以在细胞内部修复为完整质粒,长出假阳性克隆,针对这种情况,建议尽量使用双酶切并避免使用同尾酶,或加大鉴定的克隆数量。

2. 由于重组反应体系中含有盐离子,反应产物不可以直接电击转化。若需要电击转化,则需要对反应产物进行脱盐处理。由于用于反应的 DNA 很少,不推荐使用乙醇沉淀或者胶回收纯化,可使用适合微量DNA 透析的滤膜进行脱盐处理。

3. 直接使用酶切产物或 PCR 扩增产物进行重组反应时,建议添加的体积之和不超过重组反应总体积的1/5。

4. 本产品仅供科研使用。

 

 

 

常见问题解答

Q1:引物如何设计?

A1:
引物由三部分组成:同源臂(15-25 bp,不计算酶切位点和残留碱基,GC含量40%-60%)+酶切位点(按需保留或舍弃)+特异性引物(引物Tm值由特异性序列决定,计算不包括同源臂和酶切位点的序列)。
载体的线性化方式有三种:双酶切、单酶切和反向PCR,优先选择双酶切。

 

Q2: 平板上长不出克隆或克隆数目少

A2:
2.1 引物设计不正确:即同源臂序列选择不合适,应避免选择含有高级结构的同源序列。同源臂的大小应为15-20 bp(不包括酶切位点),且GC含量应在40%-60%。同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp时,基本没有重组活性,长度大于25 bp时重组效率明显下降。
2.2 载体和外源DNA纯度较低:酶切或PCR扩增获得的载体/外源DNA片段应胶回收纯化,纯化的DNA应直接溶解于ddH2O中。
2.3 载体和外源DNA的摩尔比不佳:使用更精准的方法进行外源DNA和载体的定量(用Nanodrop的方法或琼脂糖凝胶电泳的方法进行定量),建议外源DNA片段:载体的摩尔比=2:1最佳。
2.4 感受态转化效率低:使用高效感受态(108 CFU/μg以上),并将转化产物全部涂平板。
2.5 平板配置错误:选择错误的抗生素或在固体LB培养基中加入了过量抗生素。涂板时检查载体的抗性并选择正确的抗生素和浓度。
2.6 设置阳性对照:用于排查是否因操作原因、感受态效率下降、试剂酶活力下降而导致的重组效率低。
2.7 实验反应条件:建议在PCR仪或者金属浴等仪器上进行反应,温度不准会导致重组效率下降。
2.8 反应体系不合适:建议20 μL反应体系,若直接使用酶切产物或PCR产物进行重组反应时,添加的体积不用超过重组反应总体积的1/5,否则会降低重组效率。
2.9 转化体积过量:重组产物的转化体积不应该超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率。

 

Q3:阳性对照不长克隆或长得很少

A3:
3.1 抗性使用错误:24305试剂盒提供的对照载体的抗性为Amp+抗性。
3.2 感受态转化效率低:确保感受态转化效率>10cfu/μg,即将1 ng质粒转化至100 μL感受态细胞中,取1/10进行涂板,生长1000个菌斑,估算感受态转化效率为10cfu/μg;
3.3 转化体系不合适:重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率。

 

Q4:假阳性/空载体/测序无信号

A4
4.1 载体线性化处理不完全:通过阴性对照检测载体是否线性化完全,如果阴性对照长了很多克隆,可能是模板加入量过多或线性化处理不完全,可优化酶切体系,提高限制内切酶使用量并延长酶切反应时间;或者更换效率更高的限制性内切酶;胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.2 环型质粒作为PCR扩增模板增加假阳性:使用Dpn I除去含有甲基化修饰的模板(例如从DH5ɑ、DH10B等细胞中抽提的质粒模板),模板投入量不宜过多(<1 ng),否则可能导致Dpn I消化不完全从而造成假阳性;胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.3 连入非目的片段:PCR扩增获得外源DNA片段时,产生非特异片段,建议胶回收PCR产物,回收产物溶解于ddH2O中。

 

Q5:大多数克隆含有不正确片段

A5
5.1 PCR扩增外源片段不特异:优化PCR扩增体系,提高特异性;胶回收PCR产物;重新设计引物;挑取更多的克隆鉴定。
5.2 反应体系中混入相同抗性的质粒:PCR扩增模板为环状质粒时,扩增产物应进行Dpn I处理或胶回收纯化。
5.3 反应体系中混入了其它序列:进一步纯化PCR产物,排除PCR产物不纯等因素造成的影响;使用干净的耗材,ddH2O等,避免试剂或耗材带来的污染。
5.4 测序样本数太少:需要多挑几个样本测序。

 

Q6:菌落或菌液PCR无条带

A6
6.1 PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空载体条带,建议优化PCR体系、程序,同时设置阳性对照,以质粒作为PCR模板,排除人为配置体系错误可能性。或通过酶切验证是否插入外源片段。
6.2 重组反应失败:只有空载体的条带,说明重组反应失败。载体线性化不完全,建议优化酶切体系、延长酶切时间;检查引物设计等。
6.3 引物不正确:重新设计引物,若同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp,基本没有重组活性,长度大于25 bp,重组效率会有明显下降。或使用通用引物验证。

 

Q7:插入片段出现碱基突变

A7
7.1 PCR扩增过程发生突变:建议使用高保真的DNA聚合酶。
7.2 测序样本数 :如只测试一个样本,结果不一定可信,应多测试几个样本。
7.3 测序结果分析:检查突变处的测序信号是否正常,若为杂峰或双峰则不可信。
7.4 突变位置:若同源臂处发生碱基突变,考虑是引物合成问题,建议多挑取几个样本测序,或重新合成引物进行实验。

 

 

产品说明书

#24308 2 × Ezmax® Plus Universal CloneMix

pdf

1.7MB

参考文献

COA查询

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