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32045 10 × HOLMES Buffer for Cas13
产品概述
产品描述
10 × HOLMES Buffer for Cas13a 是适用于 Cas13a 蛋白反式切割反应的专用缓冲液。该反应缓冲液的成分经过优化，可有效提升 Cas13a 蛋白的反式切割活性，而不影响其检测靶标的特异性，因此，可被用于Cas13a 介导的 CRISPR 诊断反应体系。常见的 Cas13a 家族蛋白，如 LwaCas13a、LbuCas13a 和 LtrCas13a等，均可使用 HOLMES Buffer for Cas13a 作为反应缓冲液。
产品组分
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组分 |
32045-01 |
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● 10 × HOLMES Buffer for Cas13a |
5 × 1 mL |
保存条件
4℃储存；常温运输。
实验流程
以 LwaCas13a 反式剪切实验为例：
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer for Cas13a |
2 μL |
1 × |
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10 μM LwaCas13a Nuclease |
0.05 ~ 0.5 μL |
25 ~ 250 nM |
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10 μM crRNA |
0.05 ~ 0.5 μL | 25 ~ 250 nM |
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10 μM Target RNA |
0.05 ~ 0.5 μL | 25 ~ 250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05 ~ 0.5 μL |
25 ~ 250 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
· 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LwaCas13a Nuclease 可用 1×HOLMES Buffer for Cas13a 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的 Cas13a 酶长期保存，请使用 Cas13 Dilution Buffer，#32013），crRNA、Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀释，但极低浓度的 Target RNA（例如 LOD 实验）建议用 0.1% Tween20 稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
常见问题解答
Q1: nCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及NHN和RuvC两个结构域，NHN剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变，导致HNH或RuvC结构域失活，只能切割靶标dsDNA中的一条链，产生单链切口。其中，SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRN互补配对的链 (NTS链)；而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链)；此外，还有dCas9，由于H840A和D10A均发生突变，导致dCas9只能结合靶标dsDNA，但不能剪切其中任何一条链。
Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–UUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
参考文献
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