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32041 10 × HOLMES Buffer for Cas9
产品概述
产品描述
10 × HOLMES Buffer for Cas9 是适用于 Cas9 蛋白体外剪切反应的专用缓冲液。该反应缓冲液的成分经 过优化，可有效提升 Cas9 蛋白的剪切活性，而不影响其检测靶标的特异性。常见的 Cas9 蛋白，如 SpCas9、 Sp-dCas9 和 Sp-Cas9 Nickase 等，均可使用 10 × HOLMES Buffer for Cas9 作为反应缓冲液。
产品组分
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组分 |
32041-01 |
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● 10 × HOLMES Buffer for Cas9 |
5×1 mL |
保存条件
4℃储存；常温运输。
实验流程
以 SpCas9 体外剪切实验为例：
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer for Cas9 |
2 μL |
1 × |
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10 μM SpCas9 Nuclease |
0.5 μL |
250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.5 μL |
250 nM |
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1 μM Target DNA |
0.5 μL |
25 nM |
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Nuclease-free Water |
Up to 20 μL |
· 若用核酸电泳来分析剪切产物，对于 20 μL 剪切体系，推荐 target DNA 的使用量为 100-500 ng，且 target DNA 片段长度在 300 bp ~ 3kb 范围内。不同长度的 target DNA 需要的 Cas 酶和 sgRNA 的量需要根据 target DNA 的摩尔量计算，建议保持 Cas 酶：sgRNA:target DNA的摩尔比为 10：10：1，以尽量保证 target DNA 被剪切完全。实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
常见问题解答
Q1: nCas9与Cas9有什么区别？
A1: Cas9可识别并剪切dsDNA靶标，其机制涉及NHN和RuvC两个结构域，NHN剪切TS链，RuvC剪切NTS链，两者共同产生dsDNA双链断裂(DSBs)，产生平末端。但nCas9由于H840A或D10A氨基酸突变，导致HNH或RuvC结构域失活，只能切割靶标dsDNA中的一条链，产生单链切口。其中，SpCas9 H840A Nickase只能剪切靶标dsDNA中不与sgRN互补配对的链 (NTS链)；而SpCas9 D10A Nickase只能剪切靶标dsDNA中与sgRNA互补配对的链 (TS链)；此外，还有dCas9，由于H840A和D10A均发生突变，导致dCas9只能结合靶标dsDNA，但不能剪切其中任何一条链。
Q2: nCas9的sgRNA应该如何设计？
A2: nCas9的sgRNA可参照以下序列设计：
5′–UUUCGUGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUGAACGAUAAAGAUCGAGAUUUUGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（下划线表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)。
参考文献
COA查询
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