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CC96404 Y187
产品概述
产品描述
Y187 菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂、双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2。报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGADT7和pGBKT7。质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白；质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端 1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait–BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait 和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187的两个报告基因(lacZ，MEL1)，分别由两种不同的启动子(G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，因此酵母双杂假阳性发生的概率大大降低。Y187感受态细胞经特殊工艺制作，pGADT7 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
产品组分
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组分 |
CC96404-01 |
储存条件 |
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Y187 Competent Cells |
10支 × 100 μL |
-80℃，3个月 |
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pGADT7 (control vector, 10 ng/μL) |
1支 × 10 μL |
-80℃，12个月 |
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Carrier DNA (10 μg/μL) |
1支 × 100 μL |
-20℃，12个月 |
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PEG/LiAC |
1支 × 5 mL |
4℃，12个月 |
基因型：MATα,ura3-52,his3-200,ade 2-101,trp 1-901,leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1UAS -GAL1TATA-lacZ, MEL1
使用方法
1. 变性Carrier DNA：95℃，5 min，立刻冰浴5min，重复一次，然后插入冰中备用。
2. 从-80℃取出Y2HGold感受态细胞，冰上融化，依次加入预冷的目的质粒 2-5 µg，已变性的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL,吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将EP管于42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 3500 rpm离心1 min弃上清，500 µL ddH2O重悬，离心1 min弃上清。
5. 50 µL ddH2O重悬，涂板，30℃培养 48-96 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y187 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。
保存条件
Y187 Competent Cells可-80℃保存3个月；pGADT7可-80℃保存12个月；Carrier DNA可-20℃保存12个月；PEG/LiAC可4℃保存12个月。干冰运输，请勿将AH109 Competent Cells置于-20℃或者液氮中保存!
常见问题解答
参考文献
COA查询
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